プラスミド遺伝子の導入方法を知りたいけど、分かりやすく説明している記事はないかな?と思っているあなたへ。
そんな方でもこの記事を読むとプラスミドの導入方法が分かるのですぐに実験ができますよ!
プラスミド遺伝子の導入方法は、物理的、化学的、生物学的の3つがあります!
その中でもトランスフェクションやDNAについて詳しく見ていき、併せてCRISPR-Cas9ツールを使う遺伝子導入方法も紹介しますね。
化学的なことを勉強していると、難しい単語に詰まって勉強が進まないこともあるのではないでしょうか。
私は化学が苦手なのですが、そんな人のためにわかりやすくこの記事で解説しています!
この記事でもクローニングやベクターなど、難しい専門用語が少し出てくるのですが、分かりやすく言い換えているので一緒に理解しちゃいましょう♪
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目次
プラスミド遺伝子導入方法は3分類!物生化学的方法で解説
プラスミド遺伝子の導入方法は、物理的と化学的、生物学的の3つがあります!
物理的方法には、細胞に直接プラスミドを入れる方法や、電気パルスを使って、細胞膜に孔をあけて入れるエレクトロポレーション法などがありますよ。
化学的方法は、複合体を作って細胞膜に引っ付くことでプラスミドを入れます。
生物学的方法は、ウイルスが元々持っている細胞進入機構を使って、プラスミドを入れますよ。
ここからは、一つ一つの方法を詳しく見ていきますね。
物理的方法は直接かエレクトロポレーション法など
物理的方法は、細胞に直接プラスミドを入れる方法や、専用の電気パルスを使い、細胞膜に孔をあけて入れる方法がありますよ。
専用の電気パルスを使う方法は、エレクトロポレーション法と呼ばれます!
他にもこの導入方法には、マイクロインジェクションやソノポレーシ、レーザー照射などがありますよ。
専用の電気パルスなどの器具が必要だったり、ある程度慣れていないとできなかったりといったところが難しい点ですね。
遺伝子を正しい場所に導入することができたり、ベクターが必要なかったりといったよい点もありますよ!
化学的方法は複合体を作っての導入
化学的方法は、複合体を作り細胞膜に接着することでプラスミドを導入します。
まずプラス電荷をもつ化学物質と、マイナス電荷をもつ核酸を用意して、プラス電荷をもつ複合体を作ります。
作った複合体をマイナスに荷電している細胞膜に接着することでプラスミドを導入しますよ。
この導入方法では、トランスフェクション試薬と呼ばれるものを使います!
プラス電荷をもつ化学物質には、カチオン性ポリマーや、リン酸カルシウム、カチオン性資質などがあります!
ただリン酸カルシウムの場合は、プラスミドとリン酸カルシウムを混ぜ合わせて共沈殿物を作ります。
その共沈殿物細胞に引っ付くことで細胞の中に取り込まれる流れになりますよ!
化学的方法は化学毒性があったり、特定の細胞を選択して導入することが難しかったりといった短所があります。
導入効率が高く、比較的簡単に行えるといった長所もありますよ!
生物学的方法はウイルスを使った導入
生物学的方法は、ウイルスが元々持っている細胞進入機構を使って、細胞の中に遺伝子を導入します。
一般的には、アデノウイルスやレトロウイルス、レンチウイルスなどのホストゲノムに組み込まれる性質を持つウイルスを使いますよ。
アデノウイルスは、細胞の宿主範囲が広いので、多くの哺乳動物性細胞に導入して組み換えタンパク質を高発現させることができるウイルスです。
細胞に感染した後も、染色体外に残るので宿主の遺伝子に影響しないところが特徴です。
レトロウイルスは、分化細胞のゲノムに遺伝子を入れるのに効果的なウイルスですよ。
レンチウイルスは、分裂細胞と非分裂細胞に感染することで、プラスミドの導入ができます。
脳や肝臓、筋肉、網膜に効果的に形質を導入できるウイルスです。
生物学的方法は汚染の危険性や、導入遺伝子を挿入するときに変異してしまったり、免疫によって活性化しなかったりする可能性があります。
科学的方法と同じように導入効率が高く、比較的簡単に行えるといった利点もありますよ!
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遺伝子導入方法のトランスフェクションはDNAを組込むこと
遺伝子導入方法のトランスフェクションは、マイナス電荷をもつ化学物質とプラス電荷をもつ化学物質の複合体を作って細胞に入れます。
そもそもトランスフェクションという言葉が少し難しいですよね。
トランスフェクションは、核酸を細胞の中に入れる過程のことをいいます。
物生化学的方法で見たときは、化学的方法の部分になりますよ!
仕組みとしては、マイナス電荷の核酸であるDNAやRNAと、プラス電荷のリン酸カルシウムやポリマーなどをくっつけることで複合体を作る導入方法です。
この複合体は、マイナス電荷を帯びた細胞の表面に引き付けられるので、取り込まれることで遺伝子の導入ができますよ。
トランスフェクション法は市販薬ででき、遺伝子の導入サイズにも制限がないので簡単です!
トランスフェクション試薬は、DNAの導入に適した製品で絞っても種類がたくさんあります。
最先端で様々な細胞に導入ができるFuGENE4Kや実績多数なFuGENEHD、FuGENE6という製品が初代培養細胞にはぴったりですよ!
なるべく低コストでの遺伝子導入方法には、jetPEIがおすすめです。
ただjetPEIは科学毒性があったり、特定の細胞を選択して導入することが難しかったりといった欠点があります。
遺伝子導入方法CRISPR-Cas9はゲノム編集ツール!2種類ある
遺伝子導入方法の一つであるCRISPR-Cas9ツールは、プラスミド法とRNP法の2種類があります。
CRISPR-Cas9ツールと聞いてもあまりパッとしないですよね。
このツールは、Cas9ヌクレアーゼとgRNAから構成されています。
Cas9ヌクレアーゼはDNAを切断することができ、gRNAはその切断部分を認識してくっつくことでこのツールができていますよ!
主に遺伝子の機能欠損や遺伝子に新しい配列を組み込むときに使われます。
ここからは、CRISPR-Cas9ツールを使って遺伝子を導入する方法を詳しく見ていきますね。
①プラスミド法かRNP法で、CRISPR-Cas9ツールを細胞に導入します。
②導入後48~72時間培養をして、変異導入効率を検証します。
この検証ではCEL-1と呼ばれる、マッチしていないDNAを切断する酵素がよく使われますよ。
③細胞のクローニングとゲノムDNA変異の検証をします。
④できた細胞を使って目的の実験に進みましょう。
この4つのステップを踏むことで遺伝子の導入が確認できますよ♪
導入後変異導入効率を検証するとき、導入プラスミドの量が適切でないと変異導入効率が悪いことがあります。
もし変異導入効率が悪かった場合は、プラスミドの量が適切かどうか確認してみてくださいね。
細胞のクローニングは、遺伝子導入でゲノム編集した細胞の中から特定のDNA配列の細胞を検出、特定してクローンを作ることをいいますよ!
クローニングによってゲノム編集の成功を確認し、目的の実験へと進んでいきます。
もしゲノム編集で変異が入っていたら、PCR産物を熱変性し、取り除く処理をすることで2本鎖ができます。
このいらない2本鎖はCEL-1酵素が切断してくれますよ。
ここで出てきたプラスミド法とRNP法については、次で詳しく見ていきますね。
プラスミド法はDNAを細胞に取り込ませる
プラスミド法はDNAプラスミドを使って、CRISPR-Cas9ツールの塩基配列を持つDNAを細胞の中に取り込ませる方法です。
塩基配列は、アルファベットの暗号のようなものです!
DNAは、アデニンやチミン、グアニン、シトシンの4種類の塩基が基礎的に並んでいて、それぞれをアルファベットで表していますよ。
ベクターの種類は、gRNAとCas9が別々のベクターの塩基配列を持つ個別プラスミドと、gRNAとCas9を1つのプラスミドに収めた単一ベクター型(all-in-one)の2つがあります。
ベクターってなに?
ベクターは、遺伝子の運び屋さんのことをいいますよ!
個別プラスミドは、gRNAやCas9プラスミドの量を状況に合わせて変更することで、変異導入の効率が悪いときでも対応することができます。
単一ベクター(all-in-one)は、1つのプラスミドに収めることでgRNAとCas9を効率よく同時に発現することが可能ですよ!
プラスミド法で導入するときは、2つの条件があります。
- 1.0μg/μLのCas9プラスミドを５μL以下
- 1.0μg/μLのgRNAプラスミドを５μL以下
この条件は50~100万個の細胞に対しての推奨量と濃度になるので、細胞の個数によって調整が必要ですよ。
また単一ベクター(all-in-one)の場合は、プラスミドの量が合計2~8μgになるように調整しましょう。
RNP法はgRNAやCas9の複合体を細胞に導入
RNP法は、DNAプラスミドは使わずに、gRNAやCas9タンパク質の複合体を細胞に導入します。
この導入方法は、多くのgRNAを使うときやコストを抑えたいときにおすすめのやり方です。
ここで使うgRNAには、crRNAとtracrRNAが別々になっている2パートシステムと、連結しているsgRNAを使う1パートシステムの2種類があります。
2パートシステムの場合は、TransIT-CRISPRと呼ばれるトランスフェクション試薬がおすすめです。
TransIT-CRISPR試薬は、非リポソームポリマートランスフェクション試薬と呼ばれるもので、速くて高い確率でトランスフェクションできますよ♪
TransIT-CRISPR試薬を使って導入する場合の手順を紹介しますね。
- crRNA溶液とtracrRNA溶液を足したものとCas9溶液のモル比が5:1になるように混ぜます。
- crRNA溶液とtracrRNA溶液を同じ量で混ぜ合わせ、そこに1~2μLのCas9溶液を加えて30分置いてRNPを作ります。
- 低血清培地を250μL加えて、常温に戻します。
- よく混ぜたTransIT-CRISPR試薬を5~6.25μL加えます。
- 室温に15～30分置いてトランスフェクション複合体を作ってプレートに落とします。
遺伝子導入方法はDNAを細胞の外から中に取り込ませること
遺伝子導入方法は、DNAを細胞の外から中に取り込ませることをいいます!
遺伝子導入は、遺伝子・タンパク質の機能や調整機構の研究に重要な方法で、非ウイルスベクター系とウイルスベクター系の2つに分けられます。
ウイルスベクター系には、レトロウイルスやレンチウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターを使った方法が含まれますよ。
非ウイルスベクター系は、リポフェクション法やエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法など物理化学的な方法が含まれます。
DNAを確実に細胞の中に取りこむには、DNAの特性に合った導入方法を見極める必要がありますよ!
リポフェクション法は複合体を作っての導入
リポフェクション法は、マイナス電荷のDNAとプラス電荷のリポソームを結合して複合体を作り、エンドサイトーシス現象で細胞の中に取り込みます。
エンドサイトーシスってなに?
エンドサイトーシスは細胞が外から情報分子を取り込む機構のことですよ!
高価な機械を使わず、人的被害も少ないので最もよく使われる方法ですよ♪
リポフェクション試薬は、効率が大幅に変動します。
この導入方法は、導入したいDNAの性質を見極めることが重要になりますよ!
エレクトロポレーション法は孔に穴をあけて入れる
エレクトロポレーション法は、専用の電気パルスを使って、細胞膜に孔をあけてDNAを入れる方法です!
細胞の表面に小さな孔と呼ばれる穴をあけることで、そこからDNAが入り込む仕組みになっていますよ。
エレクトロポレーション法は、クローニングしたDNAを大腸菌コンピテントセルに入れるときに多く使われる方法です。
正確な位置に導入することができるので、浮遊細胞にも使うことができますよ!
マイクロインジェクション法は直接導入
マイクロインジェクション法は、先端の直径が約1μm程度のガラス芯にDNAを入れ、直接細胞の中に入れる方法です!
高価な設備が必要な上に、導入できる細胞に限度があるため、一般的な遺伝子導入には向いていません。
設備の操作に慣れていないとかなり時間がかかってしまうので、効率よく行えるかが課題になってきますね。
マイクロインジェクション法は直接細胞に入れるので、DNAの大きさや性質は関係なく、確実に導入ができる方法ですよ!
まとめ
- プラスミド遺伝子の導入方法は物生化学的の3つがある
- 遺伝子導入方法のトランスフェクションは、マイナス電荷をもつ化学物質とプラス電荷をもつ化学物質の複合体を作って細胞に入れること
- プラスミド法はDNAプラスミドを使って、CRISPR-Cas9ツールの塩基配列を持つDNAを細胞の中に取り込ませることである
- 遺伝子導入方法は、DNAを細胞の外から中に取り込ませることをいう
この記事では、プラスミド遺伝子の導入方法を、物生化学的方法で3つと、CRISPR-Cas9ツールを紹介しました。
理解できないと勉強が詰まってしまうベクターなどの専門用語も分かったので、少し親近感が湧いたのではないでしょうか。
導入遺伝子を使って、他の実験にも活かせるといいですよね!
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